De gescheiden Larry Daley (Ben Stiller), heeft ondanks zijn vasthoudende pech in het leven, het gevoel dat er iets groots staat te gebeuren. Hoe groot, weet hij zelf ook niet, totdat hij met enige tegenzin een baan als nachtbewaker in het historisch museum accepteert. Al tijdens zijn eerste dienst wordt het hem duidelijk dat hij wel eens een cruciale rol in de wereldgeschiedenis kan gaan spelen. 's nachts gebeuren er in het museum wel heel eigenaardige dingen...Iedereen en alles komt tot leven!! Met de wijze woorden en quote: don't let anything in or out!' en de hulp van het wassenbeeld van president Teddy Roosevelt (Robin Williams) probeert Larry de vechtende romaanse gladiatoren en amerikaanse cowboys weer op gelijke voet te krijgen en de rondrennende t-rex bewijst voor eens en voor altijd waarom hij bekend staat als het gevaarlijkste roofdier ter wereld. Larry zal de samenzwering binnen het museum op moeten lossen om ervoor te zorgen dat de deuren niet voorgoed zullen sluiten.

De museumbewaker Larry (Ben Stiller) gaat terug naar het museum waar hij ooit de meest magische nacht van zijn leven had. Tot zijn verbazing ziet hij dat zijn favoriete museumstukken ingepakt staan om verhuisd te worden naar de archieven van een ander museum. Als Larry een wanhopig telefoontje krijgt van de miniatuur-cowboy Jedediah (Owen Wilson), besluit hij actie te ondernemen om te voorkomen dat de kwade kamunrah het museum en uiteindelijk de hele wereld overneemt! Night at the museum 2 is een razend spannende film vol met nieuwe avonturen en een waanzinnige cast!